三角梅又称叶子花、九重葛、毛宝巾等，为紫茉莉科宝巾属常绿藤本植物。三角梅品种多样，植株适应性广，生命力强，能够花叶俱赏，且花色丰富、花期长，是很好的盆栽花卉，在园林绿化及花卉中用途很广，此外，他还含有对人类健康以及环境保护有积极作用的化学物质、市场需求很大。目前，国内对三角梅的研究多集中在栽培方面，常采用扦插繁殖，而扦插繁殖易受季节、气候等环境因素的影响，春季扦插成活率不太高，只有70%，从而使三角梅的繁殖速度受到一定限制。组织培养可以加快林木花卉的生长和繁殖速度，提高观赏价值，保持品种的优良特性并防止品种退化，在林木花卉育苗产业中具有科技支撑和保障作用。三角梅属于木本花卉，对其进行组织培养相对于草本花卉难度较大，尤其是在外植体灭菌方面。笔者对三角梅外植体进行消毒并诱导其愈伤组织，旨在为其组织培养体系的建立奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选择生长健壮无病虫害的三角梅的花、苞片、茎尖、叶片、幼嫩茎段、半木质化茎段作为外植体。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒

外植体采后放入水中用毛细刷将其表面轻轻刷洗干净，然后用流水冲洗2h，置于超净工作台上，用浓度75%酒精溶液和0.1%升汞溶液进行消毒，并在上述消毒液中加入少量表面活性剂吐温，从而使药剂更易于展布，提高材料的灭菌效果。设置5个处理组合：A，用75%酒精灭菌25s，再用0.1%升汞消毒7min；B，用75%酒精灭菌25s，再用0.1%升汞消毒8min；C，用75%酒精灭菌30s，再用0.1%升汞消毒9min；D，用75%酒精灭菌30s，再用0.1%升汞消毒10min；E，用75%酒精灭菌35s，再用0.1%升汞消毒11min。以上每个处理用75%酒精灭菌后都要用无菌水冲洗5次，然后再用0.1%升汞消毒，最后用无菌水冲洗7~8次。经消毒后的外植体用无菌滤纸吸干，苞叶和叶片切成0.5~1.0cm长的小段，然后接种在基本培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶接种5块，置于温度25℃，光照强度1000~2000 lx，每天12小时的光照条件下培养，每天观测一次。

1.2.2 诱导培养基种类：

MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2mg/L 2,4-D;‚MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA;ƒMS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D;④MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA;⑤MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA;⑥MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA。

以上培养基中均加入30 g/L糖，6 g/L琼脂粉，pH调至5.8。

2 结果与分析

三角梅的花、苞叶、茎尖在A和B处理时的污染率都为100%，在C、D处理时污染率有所下降但未污染的都被杀死，花和苞叶在E处理时全部被杀死。由此可见，三角梅的花、苞叶、茎尖很难消毒，现只统计叶片、叶柄、幼嫩茎段和半木质化茎段在不同消毒时间下的污染率、死亡率和成活率。

2.1 不同消毒时间对三角梅外植体污染率的影响

幼嫩茎段、半木质化茎段在A处理时污染率为100%，然后随着消毒时间的延长污染率逐渐降低。叶片、叶柄的污染率也随着灭菌时间的延长而下降。叶片、叶柄、幼嫩茎段和半木质化茎段具体污染情况（表1）。

2.2 不同消毒时间对三角梅外植体死亡率的影响

外植体经75%酒精和0.1%升汞消毒后会有不同程度的损伤，有些外植体虽然没有污染但已失去生理活性甚至被杀死，被杀死的外植体颜色变褐变黑，经试验，A处理叶片、叶柄、幼嫩茎段、半木质化茎段都被污染，未被杀死；幼嫩茎段和半木质化茎段经B处理均没被杀死，而叶片和叶柄在该处理中已开始有少量被杀死；在消毒时间较长的处理下，相对于叶片和叶柄，茎段的死亡率低，以半木质化茎段死亡率为最低。总之，4种外植体的死亡率都随着消毒时间的延长逐渐升高（表1）。

2.3 不同消毒时间对三角梅外植体成活率的影响

A处理幼嫩茎段和半木质化茎段全部污染，成活率为0；E处理叶片和叶柄全部被杀死，其成活率为0。除此之外，4种外植体的成活率都随着消毒时间的延长呈现“低-高-低”的趋势，叶片的成活率最高值为B处理，叶柄、幼嫩茎段和半木质化茎段的成活率最高值均出现在C处理中，并且在该处理时外植体成活率由高到低的排序依次为半木质化茎段>幼嫩茎段>叶柄。由此可知，在对三角梅外植体消毒时，应该用75%酒精灭菌30s，无菌水冲洗5次，再用0.1%升汞溶液消毒9 min，最后再用无菌水冲洗7~8次。在所有外植体中，属半木质化茎段消毒效果最后（表1）。

2.4 不同培养基对三角梅外植体愈伤组织诱导的影响

灭菌好的外植体接种在6种培养基上，每种培养基接种8瓶，每瓶放4块外植体，每天观测1次。接种后第7天，半木质化茎段切口处出现淡绿色愈伤，12d时愈伤疏松膨大成半透明状的愈伤团，外层部分愈伤颗粒略显淡紫色（图1）。

图1 三角梅茎段诱导的愈伤

第10天时，幼嫩茎段切口处长出半透明状绿色愈伤，然后逐渐膨大。叶片接种第10天开始变皱并变大，15d时切口边缘有淡绿色愈伤出现（图2），

图2 三角梅叶片诱导的愈伤

20d时愈伤颗粒增多膨大成愈伤闭。叶柄在15d时切口处开始萌动，生长缓慢。25d时，以上愈伤团有淡绿色慢慢变为黄绿色。由表2可知，4种外植体中，半木质化茎段最易诱导出愈伤，其次为幼嫩茎段，再次为叶片，叶柄诱导的最慢最少。除了叶柄在培养基和⑥上没有反应外，其余3种外植体在供试的6种诱导培养基上均能诱导出愈伤组织，但以培养基⑤诱导的愈伤组织最早最多，可以确定培养基⑤（MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA）为三角梅外植体的最佳诱导培养基。

3 结论

（1）三角梅外植体不易消毒。三角梅的花和茎尖最难消毒，由于其结构复杂，消毒时间太短达不到灭菌目的，时间太长外植体容易被杀死，因为升汞在杀死微生物的同时对活的生物细胞也有毒害作用。苞叶表面不光滑，消毒时间也很难控制。故这3种材料不易作为三角梅组织培养的外植体。

（2）在供试的7种三角梅外植体中，半木质化茎段的消毒效果最好。消毒效果由好到劣的外植体依次为半木质化茎段>幼嫩茎段>叶柄>叶片>苞叶、花、顶芽。虽然一些外植体经消毒达到了一定灭菌效果，但总体成活率并不高，最高成活率只有42%，所以今后在三角梅外植体消毒方面仍需进一步研究。

（3）供试的6种诱导培养基基本都能诱导出愈伤组织。6-BA在三角梅的愈伤组织诱导中起着非常重要的作用，浓度为0.5-2.0mg/L均可诱导出愈伤，但与不同的激素组合诱导效果也有所不同。当各组合中的激素种类、浓度一定时，NAA诱导愈伤的效果最好，其次为2,4-D，IBA诱导效果最差。该试验确定了三角梅的最佳诱导培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA，最佳诱导外植体为半木质化茎段。

（4）该试验获得了三角梅外植体的最佳消毒时间和最佳愈伤组织诱导培养基，为今后三角梅组织培养体系的建立奠定了基础。